Dúvidas sobre
doenças genéticas?
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Diferentemente do sequenciamento por Sanger, abordado no Post anterior, o processo realizado pelos Sequenciadores Next Generation (NGS) é muito mais rápido e menos custoso em questão de quantidade de amostra utilizada, quantidade de insumos necessários e no valor final por sequência de genoma inteiro. Na verdade, é subestimar a diferença apenas dizendo que é “muito menos custoso”. A diferença de custo pode chegar a ser 1 milhão de vezes menor para os sequenciamentos por NGS. Também, o tempo para sequenciar um genoma completo pode ser de aproximadamente 48h, enquanto pelo método de Sanger pode levar anos.
Realmente, os NGSs vieram para mudar drasticamente o mercado de sequenciadores, mas já era claro que com o passar dos anos a tecnologia melhoraria e, o resultado, seria um sequenciamento mais rápido e menos custoso. Mas como esses equipamentos funcionam¿ Bem, se torna mais simples responder essa questão ao comparar o processo de sequenciamento dos NGSs com o de Sanger (sistematizado no post anterior). Para começar, nos dois casos é preciso realizar a preparação da amostra. Essa preparação consiste em alguns momentos fundamentais: fragmentação da amostra, condicionamento e amplificação. Esses eventos são comuns aos dois tipos de sequenciamento, no entanto usam materiais e métodos distintos. A fragmentação ocorre da mesma maneira no Sanger e no NGS: o gene de interesse é dividido em fragmentos menores. Após isso, aos fragmentos obtidos é adicionado às suas extremidades 2 sequências: um par de primers e um par de Sequências de Captura. O condicionamento no método de Sanger serve apenas para permitir que seja realizado o PCR, por isso a adição apenas de Primers. Já no NGS, esse condicionamento serve ao mesmo propósito, mas também serve para permitir que o fragmento seja capturado pelas paredes da Flow Cell – que é por onde ocorre o escoamento da amostra preparada. Agora, para entender o processo de amplificação, é necessário antes intender a estrutura da Flow Cell. Esta é uma parte dos equipamentos de NGS que é onde a amostra é aplicada para a análise. Ela se apresenta como um grupo de tubos pequenos associados à uma placa. Associado às paredes desse tubo estão presentes as sequências opostas às Sequências de Captura – o que permite com que as duas se liguem para formar uma dupla fita. Esse momento é essencial para a amplificação da amostra, pois é nas paredes dos túbulos que ela será realizada. Visto que há as sequências de captura estão presentes nas duas extremidades de cada fragmento, existe uma tendência a esses fragmentos se dobrarem e se ligarem à parede. Nesse momento é injetado no lúmen uma solução rica em nucleotídeos e DNA-polimerase. Inicia-se, então, a amplificação da amostra através da PCR – que seria, em síntese, o aumento da quantidade de amostra para que ela possa ser analisada. Porém, a amplificação não serve apenas o objetivo de aumentar a quantidade de amostra, mas também para criar uma nova fita de DNA que continue a partir das sequências opostas às Sequências de Captura – estando, dessa forma, ligadas fisicamente a parede da Flow Cell. Nesse sentido, para permitir que apenas esses novos fragmentos originados da PCR permaneçam dentro da Flow Cell, ela é lavada por dentro, o que retirar os outros fragmentos. Esse processo é repetido várias vezes no intuito de preencher todos os espaços da Flow Cell. Agora, a amostra está pronta para iniciar o processo de análise. A ideia geral dos NGS é muito semelhante à do sequenciamento por Sanger, visto que os dois usam sinais luminosos provenientes da fluorescência dos terminadores. Porém, enquanto no Sanger as sequências precisam ser feitas de diferentes tamanhos e passar por cromatografia, os NGS são bem mais avançados nisso. Isso porque, os NGS usam terminadores fluorescentes reversíveis, que são iguais a nucleotídeos terminais fluorescentes comuns, mas com a capacidade de ter o elemento fluorescente retirado da molécula; e de converter o terminador em grupo hidroxila novamente, o que permite continuar a sequência. Desse modo, apenas esse tipo de nucleotídeo é inserido na Flow Chart junto à DNA-polimerase. O processo de replicação se inicia, mas é interrompido já no primeiro nucleotídeo, visto que este já é um terminal. Após isso, é realizada uma imagem para saber qual das 4 cores (representando as 4 bases nitrogenadas) está sendo mostrada. Então, o terminador já associado à molécula de DNA é revertido em um nucleotídeo comum, o que permite a replicação continuar por mais um nucleotídeo. O ciclo se repete até que a Dessa maneira, é possível observar qual nucleotídeo está sendo adicionado à molécula, o que permite uma análise bem mais rápida e fiel. Esses equipamentos são os novos queridinhos do mercado de sequenciadores, visto sua rapidez e baixo custo por sequência. Entretanto, eles ainda são uma compra muito cara a ser feita, por isso muitos estabelecimentos optam por continuar a usar o método de Sanger. Entretanto, ainda sim, eles são uma ótima promessa de futuro para a pesquisa genética e tratamento diferencial e integral para os pacientes em breve. Esse foi o segundo post da série “Sequenciamento Genético”. O intuito de ambos os posts foi abordar os eventos associados à realização dos dois métodos de Análise. Por: Freddy Romanno Aires Nader, Acadêmico do curso de Medicina da UNILA.
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A síndrome de Hutchinson-Gilford (HGPS) é uma doença genética rara (com uma prevalência de 1 em 20 milhões) caracterizada por manifestações semelhantes ao envelhecimento precoce causada por mutações heterozigóticas no gene LMNA (que codifica lâmina do tipo A), com mais de 90% dos pacientes carregando uma mutação pontual c.1824C> T (pG608G). Esta mutação ativa o uso de um sítio doador de splice 5 'alternativo no exon 11 que resulta na deleção de 150 nucleotídeos do mRNA e a síntese de uma proteína truncada chamada progerina. Esta proteína aberrante se acumula no envelope do núcleo devido à farnesilação irreversível e causa alterações graves nas funções celulares principalmente como um fator que leva a distúrbios na organização da heterocromatina, mitose, replicação e reparo do DNA e transcrição gênica.
O rastreamento de doenças genéticas faz parte do acompanhamento pré-natal de gestantes e a avaliação dependerá de diversos fatores, como a probabilidade do desenvolvimento de anormalidades genéticas e possíveis riscos no caso da realização de exames mais invasivos.
Dessa maneira, existem uma série de exames que podem ser solicitados pelo médico obstetra, ou geneticista, quando for o caso, para o diagnóstico pré-natal de doenças genéticas. São eles: Ultrassonografia pré-natal: Exame não invasivo e sem risco conhecido para a mãe ou bebê. No segundo ou terceiro trimestre pode identificar malformações de estruturas cranianas, rins, coração, coluna, ossos e etc. Quando a ultrassonografia é direcionada, pode-se identificar precocemente doenças como microcefalia, hérnia diafragmática e malformações renais como a Síndrome de Potter, por exemplo. Amniocentese: Comumente, indicada após a décima quarta semana, visto que antes desse período os riscos de aborto espontâneo são aumentados. Assim, esse exame apenas é indicado quando se há suspeitas de doenças genéticas a partir de exames anteriores ou histórico familiar. Dessa maneira, é coletado líquido amniótico e células fetais a partir de uma agulha inserida via transabdominal, para testes genéticos e medição de marcadores, por exemplo. Sendo possível acusar diversas doenças, tais como: anemia falciforme, distrofia muscular e fibrose cística, por exemplo. Amostragem do vilo corial: Aspira-se as vilosidades coriônicas por meio de uma seringa e após a cultura celular as células são analisadas. Esse exame fornece as mesmas informações da amniocentese, porém a biópsia do vilo corial é feita entre a décima semana e o fim do primeiro trimestre de gestação. Cariótipo fetal: A partir da coleta da amostra de sangue fetal (por amniocentese ou por biópsia do vilo corial) pode ser feito o cariótipo para a análise de alterações a nível de cromossomo. Pode-se investigar trissomias, por exemplo, como a Síndrome de Down, Síndrome de Patau, Síndrome de Edwards. Além desses exames, também são solicitados, tradicionalmente, como triagem do primeiro trimestre a dosagem de: Beta-hCG sérica materna, uma vez que altos níveis podem ser associados com a Síndrome de Down; medição da proteína do plasma A (PAPP-A), visto que baixos níveis dessa proteína estão relacionados com o aumento da translucência nucal (por ultrassonografia), indicando risco para Síndrome de Down e cardiopatias congênitas, por exemplo. Dessa maneira, esses são alguns exemplos de exames de rastreio de doenças genéticas realizados no período pré-natal para a identificação de doenças genéticas, ainda no período intrauterino, de acordo com o histórico familiar, avaliação de risco e peculiaridades de cada paciente. Por: Camila Begui, Bióloga e Acadêmica do curso de Medicina da UNILA. REFERÊNCIAS: XAVIER, J. Pré-natal é essencial para o diagnóstico precoce de doenças raras. FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 2017. Disponível em: https://portal.fiocruz.br/noticia/pre-natal-e-essencial-para-o-diagnostico-precoce-de-doencas-raras. Acesso em: 3 de nov. de 2021. DUNGAN, J. Exames diagnósticos pré-natais. Manual MSD, Canadá, 2019. Disponível em: https://www.msdmanuals.com/pt/casa/problemas-de-sa%C3%BAde-feminina/detec%C3%A7%C3%A3o-de-dist%C3%BArbios-gen%C3%A9ticos/exames-diagn%C3%B3sticos-pr%C3%A9-natais?query=Avalia%C3%A7%C3%A3o%20gen%C3%A9tica . Acesso em 4 de nov. de 2021. |
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Maio 2022
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