Dúvidas sobre
doenças genéticas?
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Em abril de 2005, na cidade de Toronto, uma mãe foi indiciada por infanticídio de seu filho recém-nascido através de overdose de morfina. O caso ganhou alta repercussão e resultou em um relato de caso pelo hospital responsável pelo parto e cuidados do bebê. Investigações subsequentes mostraram que a obstetra da mãe havia prescrevido Codeína no intuito de amenizar as dores do pós-parto. O que a obstetra não sabia é que a mãe tinha um tipo genético diferente: ela era uma metabolizadora ultrarrápida.
Os metabolizadores ultrarrápidos são capazes de realizar os processos de transformação biológica comum ao organismo humano de certos compostos em maior velocidade e quantidade do que os metabolizadores normais, os quais compreendem a maior parte da população. Isso se torna bastante relevante para a dosagem de fármacos, visto que isso pode gerar em maior ou menor efeito devido a velocidade da metabolização desses. A Codeína é um pró-fármaco, ou seja, uma droga que precisa ser transformado em outro composto para que tenha efeito no organismo humano; que seria a Morfina, um forte opioide bastante eficaz em aliviar a dor. No caso em questão, o bebê sofreu overdose devido a morfina presente no leite materno. Isso foi provado com análise do citocromo P450, responsável pela metabolização de aproximadamente 70% de todos os fármacos terapêuticos usados em humanos, e pela análise do leite materno, onde foi encontrado dose 3 vezes maior de morfina do que o máximo esperado para mães amamentando e usando codeína. Os retrovírus endógenos (ERVs) são partes de DNA de infecções ancestrais que tiveram sua origem em retrovírus exógenos ao longo do tempo, e que conseguiram se inserir no genoma e serem herdados entre as gerações. Isso acontece quando um vírus infecta as células de um hospedeiro, a fita do RNA do vírus é convertida em DNA pela enzima transcriptase reversa. Ao infectar também as células germinativas, pode haver transmissão vertical por herança mendeliana. Os ERVs estão presentes em muitas espécies, incluindo mamíferos, e normalmente, são considerados geneticamente defeituosos pelo que podem ser suprimidos facilmente pelo corpo, mas em outras ocasiões podem ser expressos e replicados no indivíduo
O Teste do Pezinho é um exame feito a partir do sangue coletado do calcanhar do recém-nascido, que deverá ser realizado após 48 horas do nascimento e a criança ter sido alimentada, preferencialmente entre o 3º e o 5º dia de vida. A realização do teste é obrigatória em todo o território brasileiro. O objetivo do exame é identificar doenças genéticas e metabólicas que não apresentam sinais e sintomas logo no nascimento, mas que podem desencadear deficiência intelectual, o que compromete a qualidade de vida e saúde da criança (FEPE, 2021; UNICAMP, SI).
O "Teste do Pezinho" foi introduzido no país na década de 70 com o intuito de identificar duas doenças (chamadas pelos especialistas de "anomalias congênitas", porque se apresentam no nascimento): a fenilcetonúria e o hipotireoidismo. Ambas, se não tratadas a tempo, podem levar à deficiência mental. Até o ano de 2001, a triagem neonatal no Brasil era realizada por iniciativa de diferentes instituições, com grandes diferenças entre os vários Estados, apesar da existência de leis federais desde 1990 que tornavam obrigatória a realização dos testes. A implementação do Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN), mediante a Portaria do Ministério da Saúde nº 822, de junho de 2001, tornou viável a implantação da triagem neonatal em todos os Estados (FRANÇA; DOMINGOS, 2008; UNICAMP, SI). Quando encontrado um caso positivo faz-se o encaminhamento para tratamento, o mais rápido possível, reduzindo as chances de que o recém-nascido venha a desenvolver complicações graves causadas pelas doenças pesquisadas. Atualmente o teste do pezinho, gratuito e realizado pelo Sistema Único de Saúde (SUS), no estado do Paraná, atualmente detecta as seguintes doenças: Fenilcetonúria, Hipotireoidismo Congênito, Fibrose Cística, Doença Falciforme e outras Hemoglobinopatias, Deficiência de Biotinidase; Hiperplasia Adrenal Congênita, Deficiência da desidrogenase acetil CoA de cadeia curta (SCAD), Deficiência da desidrogenase acetil CoA de cadeia média (MCAD), Deficiência da desidrogenase acetil CoA de cadeia longa (LCHAD), Deficiência da desidrogenase acetil CoA de cadeia muito longa (VLCAD) e Deficiência do transporte da carnitina primária (CTD) (FEPE, 2021). No ano de 2021, foi sancionada a Lei nº 14.154, que ampliou para 50 o número de doenças rastreadas pelo Teste do Pezinho oferecido pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Com a nova lei, o exame passará a abranger 14 grupos de doenças. Essa ampliação ocorrerá de forma escalonada e caberá ao Ministério da Saúde estabelecer os prazos para implementação de cada etapa do processo. Por: Jéssica Albino, Enfermeira e Acadêmica do curso de Medicina da UNILA. Referências FEPE. Programa de Nacional de Triagem Neonatal. Curitiba. Disponível em < https://www.fepe.org.br/teste-do-pezinho/. Acesso em: 25 nov. 2021. FRANÇA, S. N.; DOMINGOS, M. S. Triagem neonatal do hipotireoidismo congênito: novas conquistas e novos desafios. Arq. Bras. Endocrinol. Metab., São Paulo, vol.52, no.4, 2008. UNICAMP. Teste do Pezinho. Disponível em:<https://www.fcm.unicamp.br/fcm/cipoi/triagem-neonatal/teste-do-pezinho>. Acesso em: Acesso em: 25 nov. 2021. Diferentemente do sequenciamento por Sanger, abordado no Post anterior, o processo realizado pelos Sequenciadores Next Generation (NGS) é muito mais rápido e menos custoso em questão de quantidade de amostra utilizada, quantidade de insumos necessários e no valor final por sequência de genoma inteiro. Na verdade, é subestimar a diferença apenas dizendo que é “muito menos custoso”. A diferença de custo pode chegar a ser 1 milhão de vezes menor para os sequenciamentos por NGS. Também, o tempo para sequenciar um genoma completo pode ser de aproximadamente 48h, enquanto pelo método de Sanger pode levar anos.
Realmente, os NGSs vieram para mudar drasticamente o mercado de sequenciadores, mas já era claro que com o passar dos anos a tecnologia melhoraria e, o resultado, seria um sequenciamento mais rápido e menos custoso. Mas como esses equipamentos funcionam¿ Bem, se torna mais simples responder essa questão ao comparar o processo de sequenciamento dos NGSs com o de Sanger (sistematizado no post anterior). Para começar, nos dois casos é preciso realizar a preparação da amostra. Essa preparação consiste em alguns momentos fundamentais: fragmentação da amostra, condicionamento e amplificação. Esses eventos são comuns aos dois tipos de sequenciamento, no entanto usam materiais e métodos distintos. A fragmentação ocorre da mesma maneira no Sanger e no NGS: o gene de interesse é dividido em fragmentos menores. Após isso, aos fragmentos obtidos é adicionado às suas extremidades 2 sequências: um par de primers e um par de Sequências de Captura. O condicionamento no método de Sanger serve apenas para permitir que seja realizado o PCR, por isso a adição apenas de Primers. Já no NGS, esse condicionamento serve ao mesmo propósito, mas também serve para permitir que o fragmento seja capturado pelas paredes da Flow Cell – que é por onde ocorre o escoamento da amostra preparada. Agora, para entender o processo de amplificação, é necessário antes intender a estrutura da Flow Cell. Esta é uma parte dos equipamentos de NGS que é onde a amostra é aplicada para a análise. Ela se apresenta como um grupo de tubos pequenos associados à uma placa. Associado às paredes desse tubo estão presentes as sequências opostas às Sequências de Captura – o que permite com que as duas se liguem para formar uma dupla fita. Esse momento é essencial para a amplificação da amostra, pois é nas paredes dos túbulos que ela será realizada. Visto que há as sequências de captura estão presentes nas duas extremidades de cada fragmento, existe uma tendência a esses fragmentos se dobrarem e se ligarem à parede. Nesse momento é injetado no lúmen uma solução rica em nucleotídeos e DNA-polimerase. Inicia-se, então, a amplificação da amostra através da PCR – que seria, em síntese, o aumento da quantidade de amostra para que ela possa ser analisada. Porém, a amplificação não serve apenas o objetivo de aumentar a quantidade de amostra, mas também para criar uma nova fita de DNA que continue a partir das sequências opostas às Sequências de Captura – estando, dessa forma, ligadas fisicamente a parede da Flow Cell. Nesse sentido, para permitir que apenas esses novos fragmentos originados da PCR permaneçam dentro da Flow Cell, ela é lavada por dentro, o que retirar os outros fragmentos. Esse processo é repetido várias vezes no intuito de preencher todos os espaços da Flow Cell. Agora, a amostra está pronta para iniciar o processo de análise. A ideia geral dos NGS é muito semelhante à do sequenciamento por Sanger, visto que os dois usam sinais luminosos provenientes da fluorescência dos terminadores. Porém, enquanto no Sanger as sequências precisam ser feitas de diferentes tamanhos e passar por cromatografia, os NGS são bem mais avançados nisso. Isso porque, os NGS usam terminadores fluorescentes reversíveis, que são iguais a nucleotídeos terminais fluorescentes comuns, mas com a capacidade de ter o elemento fluorescente retirado da molécula; e de converter o terminador em grupo hidroxila novamente, o que permite continuar a sequência. Desse modo, apenas esse tipo de nucleotídeo é inserido na Flow Chart junto à DNA-polimerase. O processo de replicação se inicia, mas é interrompido já no primeiro nucleotídeo, visto que este já é um terminal. Após isso, é realizada uma imagem para saber qual das 4 cores (representando as 4 bases nitrogenadas) está sendo mostrada. Então, o terminador já associado à molécula de DNA é revertido em um nucleotídeo comum, o que permite a replicação continuar por mais um nucleotídeo. O ciclo se repete até que a Dessa maneira, é possível observar qual nucleotídeo está sendo adicionado à molécula, o que permite uma análise bem mais rápida e fiel. Esses equipamentos são os novos queridinhos do mercado de sequenciadores, visto sua rapidez e baixo custo por sequência. Entretanto, eles ainda são uma compra muito cara a ser feita, por isso muitos estabelecimentos optam por continuar a usar o método de Sanger. Entretanto, ainda sim, eles são uma ótima promessa de futuro para a pesquisa genética e tratamento diferencial e integral para os pacientes em breve. Esse foi o segundo post da série “Sequenciamento Genético”. O intuito de ambos os posts foi abordar os eventos associados à realização dos dois métodos de Análise. Por: Freddy Romanno Aires Nader, Acadêmico do curso de Medicina da UNILA. |
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Maio 2022
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